Semana 16 29/10

Hoy no trabajamos, no hicimos ninugna ensayo porque empezamos a escribir la monografia, y tambein pudimos sacarnos dudas teoricas de las cosas que habiamos hecho.

Semana 15 22/10

Cuando llegamos al lab, maanu nos conto que los western de la semana pasada no le habian dado tan bien como necesitaba, porque habia levantado la muestro a las 4 horas de la irradiacion con UVC. A ese tiempo la polimerasa sufre una alta degradacion, posible caustante del "aml" resultado del western.
Por lo tanto, hoy volvimos a hacer un western, pero ahora con un control, una muestra levantada a la hora y otra muestra levantada a las dos horas y media, para 4 anticuerpos distintos(pero los mismos que la semana pasada)
Tambien empezamos a delinear como iba a ser la monografia que tenemos que presentar mas adelanta.

Semana 14 15/10

Entre todas las lineas de investigación que Manu tiene, una es entender cuales son los factores asociados a la RNA pol II y ver si estos cambian cuando esta hiperfosforilada (cuando la célula es irradiada con luz UV) o si esta hipofosforilada(en condiciones normales).
Para esto lo que va a hacer es una inmunoprecipitacion, que conciste en que un anticuerpo por un lado identifica a la Pol II, junto con sos factores asociadas, y depues ese mismo anticuerpo reconozca un peso(literalmente) y este haga que el anticuerpo junto con la RNA Pol II precipite junto con sus factores. De esta forma se "purifica" a la enzima/proteína en cuestión.
Luego mediante la espectroscopia de masa, se pude determinar que proteínas están asociadas a la pol II. Depuse se puede ver cual es la función de cada factor respecto a la velocidad de elongación de la RNA Pol II.

para esto, manu necesita que el anticuerpo que use sea muy muy especifico, y en el western de separación de la RNA Pol II del resto de la proteína, no de manchas, y de lindo.

por eso hoy hicimos un western de la misma muestra pero con distintos anticuerpos.

la semana que viene les contamos los resultados!!

Semana 13 8/10

como vale no podia estar con nosotros, y manu llego el jueves a la tarde,
el jueves 8/10 no fuimos al lab.

mas novedades la semana que viene!!

Semana 12 1/10

Como ya les habiamos contado la semana pasada, hoy hicimos una PCR. En realidad lo que hicimos fue poner a punto una PCR para Petri, uno de los chicos del laboratorio.
Lo que hicimos fue programar en la cicladora un gradiente de temperatura para ver a cual se pegaban mejor los primers(annealing, 58ºC->68ºC) y 3 distintas concentraciones de Magnesio(50mM, 100mM y 150mM , para ver cual era la que mejor funcinaba y depsues mediante una electroforesis en gel de agarosa 2% ver cual era la combinacion justa. Los wells de la misma columna recibieron la misma temperatura de annealing y los wells de la misma fila tienen la misma concentracion de magnesio.
Como los productos de la PCR diferian en tan solo 20pb, hicimos un gel 2% y no 1% porque tiene mayor poder de resolucion, esto quiere decir que puede separa mejor debido a que el tamaño de los poros es mas chico.

Lo que decidimos fue que la que combiene es la que recibio 68ºC y tenia 50mM de Mg, dado que al haber recivido mayor temperatura aumento la especificidad del pegado de primeres, con lo cual se produce menos "basura" y como tenia 50mM la actividad de la Taq fue mas especifica.

Hasta la semana que viene!

Semana 11 24/9

esta semana seguimos con vale, y lo que hicimos fue ver al microscopio las celulas de la tincion de la semana pasada
Dado que el colorante emite fluorescencia con luz UV, fuimos al microscopio de fluorescencia para verlas.
se podia distinguir los nucleos de las celulas.
la semana que viene con Vale vamos a hacer una PCR, y su revelado

hasta la semana que viene!

Semana 10 17/9

Hoy lo que hicimos fue realizar todos los pasos de una tincion especial para ver si nuestra población de células estaba contaminada con micoplasma, hongos o levadura.
Esta es la tincion de Hoechst, el cual es un compuesto que se intercala en el ADN, y emite fluorescencia a cierta longitud de onda. A la hora de revelar la tincion, en el miscropio se vera, una zona de densa coloración que sera el núcleo, y otros puntos de luminiscencia que serán las mitocndrias y en menor tamaño serán los contaminantes. No llegamos a revelar la tincion por cuestiones de tiempo

También vale nos enseño a usar la cámara de Neubauer. Esta cámara es un portaobjeto que tiene una grilla hecha y permite contar facilmente las células. El numero contado por diez a la cuarta, es la cantiad de células que hay en un mililitro de medio.

la semana que viene les contamos como nos fue con la tincion

Semana 9 10/9

Como el Dr. Muñoz se fue a Europa a una seria de conferencias y meetings, por el mes de Septiembre vamos a estar con la Dra Valeria Buggian, que es la encargada del cuarto de cultivo para el grupo ARK.

El jueves 9/10 vale nos explico en consiste su trabajo. Después fuimos al cuarto de cultivo, nos explico el funcionamiento en general del cuarto, y las responsabilidades.
También, vale habia preparado unas placas con células para que nos encarguemos por este mes de su mantenimiento. Entonces, ese jueves lo que hicimos fue hacer un pasaje. Este pasaje consiste en primero ver en que esta están las células de la plica, es decir cuantas células, aproximadamente, hay en la placa. Esto se hace para saber, mas o menos que dilución hay que hacer. Una vez que sabes cuantas células hay, se retira el medio, se lo lava con PBS (una solución isotónica, se retira el PBS, se agrega tripsina que sirve para que las células se despegan de las proteínas que están haciendo de matriz extracelular. Esperamos unos minutos, le agregamos un poco de medio que tiene proteínas bobinas y tomamos la alícuotas deseadasegún la dilución que queramos hacer.

Semana 8 3/9

El jueves 20/8 y 27/8 mati y yo estábamos en bariloche, con lo cual no fuimos al laboratorio.

Lo que hicimos hoy fue extraer y purificar ARN de dos lineas celular, que habían sido tratadas con luz UVC y UVB, con su correspondiente control.

Lo que se hizo fue poner a las células en un medio con Fenol y acetato de sodio, para destruir las mebranas y distintos componentes celulares. Luego se recogen las celulas en un tubo eppendorff y se le agregan 0.2ml de cloroformo, cuya función es ayudar a destruir y a separa en dos fases(ya que es menos polar que el fenol)
Después se mezcla y se centrifuga, lo que genera 2 fases una acuosa y otra orgánica. A nosotros nos interesa la fase acuosa, polar, ya que el ARN es polar. A la fase acusa se la agrega 0.5ml de isopropanol lo que baja la polaridad del medio, generando que el ARN precipite. Después de dejarlo a temperatura ambiente por 20 min se lo centrifuga a 12.000G por 10 min. Cuando se retiran los tubos de la centrifuga se ve en el fondo un precipitado(pellet) que esta fuertemente agarrada al tubo. Se descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de etanol 70% y se centrifuga a 7600g por 5 min. Se descarta el sobrenadante, con cuidado ya que la polaridad del etanol 70% es bastante intermedia y el ARN es parcialmente soluble en el mismo.Una vez descartado el sobrenadante se dejan los tubos abiertos para que se evapore lo que haya quedado de etanol.Una vez seco se le agregan 1.5-2ml de agua
Por ultimo se llevan los tubos a -80ºC por 5 min, después a 55ºC por 5 min y se vortexea.
finalmente tenemos al ARN, supuestamente puro.

Hay que destacar que lo mas complicado de una extracción no es la extracción en si mismo si no que es la predicación, extraer solamente lo de interés y no lo que es parecido, como puede ser el ADN. Es por eso que se juega con la polaridad del medio, ya que el ADN es menos polar que el ARN ya que cuenta con un OH menos(ácido DESOXIribonucleico)

Esta extracción y purifican viene seguida de una retrotranscripcion, un PCR radiactiva, y una electroforesis en poliacrilamida.

La semana que viene Manu se va a dar unas charlas por eruopa, con lo que no vamos a tener pasantia hasta el 8 de octubre. a la vuelte les traemos novedades

saludos

Semana 7 6/8

Hoy, después de un buen tiempo sin vernos, nos reencontramos con Manu.
Mati no puedo ir porque tenia que rendir un final de IPC por UBA XXI

En este periodo en el que no estuvimos, manu siguió investigando el cambio en los patrones de Splicing Alternativo en células irradiadas con luz UVB, que es la que llega a la tierra desde el sol. En ese tiempo, después de analizar resultados se dio cuenta que el cambio en lo patrones de SA en células irradiadas con luz UVC no es dependiente de la posibilidad de realizar apoptosis por parte de la célula. Y también vio que el cambio en los patrones de SA por daño con UVC no depende de esta posibilidad de morir, que se ve representada en la célula por el aumento o disminución de el factor de transcripción p53. Pero, en oposicion, para que el daño con UVB (de menor energía que la UVC)cambie los patrones del SA SI tiene que estar presente p53. En realidad esto es un leve indicio.
Por esto es que hoy irradiamos con luz UVB y UVC a unas células sin la posibilidad de aumentar la cantidad de p53 y otras que si tienen la capacidad de aumentar la cantidad de p53. La semana que viene les contamos los resultados

Esto es todo por esta semana.
En los proximos días vamos a subir la introducción que tenemos que entregar para el 19/8

Saludos

Receso

Debido a la emergencia sanitaria, no fuimos durante dos semanas a la pasantia.
A estas dos semanas se les sumaron las 2 semanas de receso invernal.
Con lo cual no fuimos a la pasantia por un mes.

Semana 6 18/6

El jueves 18/6 lo que hicimos fue una electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas, con la intención de realizar un Westernblot después. El Westernblot consiste en la identificación de una proteína, utilizando la electroforesis en poliacrilamida como método separativo en una mezcla de proteínas. Luego de la electroforesis lo que se hace es transferir las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. A la membrana se le agrega una solución de un anticuerpo específico para esa proteína. Lo particular del anticuerpo es que tiene adherido una enzima, que con su sustrato correspondiente libera luminiscencia, que será proporcional con la cantidad de proteína presente. Con la cual, el Western blot es tanto un método cuantitativo como cualitativo

La electroforesis en gel de poliacrilamida tiene la particularidad de ser vertical. Con la cual cuando se siembra la muestra, puede que no entre al mismo tiempo en el gel, con lo cual corrida daría con error. Para esto lo que se hace es prepara un gel concentrador que es poliacrilamida. La proteínas primero entran en contacto con el gel concentrador y después con el separador y de esta forma entran todas al mismo tiempo.

Otra particularidad para la electroforesis en poliacrilamida de proteínas, es que se las debe desnaturalizar, para que la carga y forma no sean una variable a la hora del avance y el peso sea lo único que determina cuanto migra la muestra. Para esto se le agrega un detergente, el SDS o dodecilsulfato de sodio; su función es cargar todas las proteínas negativamente y además rompe uniones no covalentes dentro de las cadenas polipeptídicas y de esta forma las desnaturaliza.

Gel concentrador: 3ml finales

• agua destilada: 2,1 ml
• acrilamida mix 30%: 0,5 ml
• 1M tris(pH 6,8): 0,38
• SDS 10%: 0,03
• APS 10%: 0,03
• Temed :0,03
  

Gel Separador 6%: 10ml

• Agua: 5,3
• Acrilamida 30%: 2 ml
• 1,5M tris(pH8,8) 2,5 ml
• SDS 10%: 0,1ml
• APS 10%: 0,1ml
• Temed :0,008ml

El APS y el Temed, son para desencadenar la polimerizacion de la acrilamida
Cuanto mas concentrado el gel, mas finos son los poros, lo que significa mas resolucion del gel. Es decir, puede separa mejor las cosas pro su tamaño

Semana 5 11/6

Como a manu algunos experimentos le dieron menor cantidad, decidió ver si plasmidos de VP16 nuevo, estaba bien y había solo plasmido, o había otras cosas.
Para esto lo que hicimos fue hacer una restricción de un plasmidos viejo de VP16 que si sabemos que es el plasmido solo una restricción del plasmido nuevo. Para ahcer la restricción lo que hicimos fue cortar los plamidos con 3 enzimas de restricción diferentes, para poder tener mas comparaciones.
lo que hicimos fue:

1. Poner un un tubo el volumen en el que halla 1,5 ug de plasmido(x3para el viejo y para el nuevo)
   
2. poner 2 ul del Buffer, correspondiente a cada enzima, en cada tubo(uno nuevo y uno viejo)
3. poner un volumen de agua destilada para llegar a 20ul finales
   
4. poner 1ul de enzima, una enzima por tubo. Las enzimas usadas fueron Eco RI, BanHI y XhoI.
5. llevar a incubar a 37ºC por 1h

luego para poder ver en cuantos fragmentos se cortaban los palsmidos, hicimos una electroforesis en gel de agarosa 1%. Si el plasmido nuevo tiene solo el plasmido de VP16, las bandas que aparecen en la electroforesis debería ser igual entre el viejo y el nuevo cortados con la misma enzima. Pero si parecen bandas que no coinciden con las del plasmido viejo, significa que hay algún contaminante.
No pudimos ver el resultado de esta electroforesis porque no llegábamos con el timepo.
Manu tampoco puedo analizar los resultados de la electroforesis en poiliacrilamida de la semana pasada y tampoco pudo analizar los resultados del daño con UVB de la semana pasada.
Así que la semana que viene les traemos todos los resultado!!

Mapa de Restriccion

Aca les dejo el mapa de restriccion del plasmido pBR322
pBR322

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Enzimas de Restriccion y plasmidos

Las Enzimas de restricción, son enzimas que tienen las bacterias cuya función es defender su propio material genético ante la aparición de otro ADN proveniente, por ejemplo, de un fago. Lo que hacen, es cortar el ADN en una secuencia especifica, no aleatoriamente. Esas secuencias especificas de corte de las enzimas de restricción (ER) se llaman sitios de restricción. Esta especificidad es lo que las hacen útiles en biología molecular, siendo las tijeras moleculares. Las ER pueden cortar de forma escalonada, o recta.

Los plasmidos son ADN circular extracromosomico que tienen las bacterias. No tienen genes básicos para la vida de las bacterias, generalmente tienen genes que codifican para una resistencia a antibióticos. Gracias a q son chicos, son los vectores de genes chicos por excelencia. Definimos vector como molécula chica de ADN capaz de introducir una secuencia de interés dentro de un huésped. Principalmente debe poder replicarse independiente del ADN del huésped. Un mapa de restricción es una mapa de todos los lugares del plasmidos donde es cortado por las diferentes ER

Sabiendo el sitio de restricción de la ER de interés, y teniendo un mapa de restricción del plasmido utilizado se puede de esta forma, cortar el plasmido dejándolo habierto, y en esa apertura se puede introducir la secuencia de interés.
Combinado estas dos herramientas se puede introducir un secuencia de interés, por ejemplo el gen de la insulina, dentro de una bacteria y que esta bacteria produzca insulina. Luego esta insulina se puede purificar y comercializar.

Acá les dejo un cuadro, con algunas enzimas de restricción.

cuadro de ER

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Semana 4 4/6

Una de las preguntas que Manu intenta responder es si los cambios que observa en los patrones de SA, y que favorecen la apoptosis, se dan también cuando la vía apoptótica esta inhibida. Para esto, nos comentó que había hecho una PCR radioactiva sobre un ADNc obtenido a partir de ARN extraído de células irradiadas con luz UVC pero con el mecanismo apoptótico inhibido. Para analizar lo ocurrido con la PCR radioactiva realizamos una electroforesis en geles de poliacrilamida (en poliacrilamida y no en agarosa, porque la poliacrilamida permite luego el revelado en placas fotográficas, permitiendo una mejor cuantificación de los productos de PCR).

No pudimos ver el resultado ya que tardaba 1 hora en terminar la corrida, y nos fuimos antes de terminarla. Así que la semana que viene Manuel nos va a contar cuales fueron los resultados

Gel de poliacrilamida:

1. TBE
2. Acrilamida
3. Bisacrilamida
4. Temed, tretametil-etilendiamina
5. Persulfato de amonio

El temed y el persulfato de amonio, son los catalizadores por radicales libres de la polimerización de la acrilamida/bisacrilamida.

Respecto al procedimiento de la electroforesis en gel de poliacrilamida, es prácticamente igual que una en gel de agarosa excepto que:

1. La corrida se hace de forma vertical y no horizontal.
2. El buffer de corrida no es TAE (tris-acetato-EDTA) sino TBE (tris-borato-EDTA), el cual tiene una mayor capacidad reguladora.
3. El buffer de siembra tiene además de glicerol y azul de bromofenol otro colorante más que es el xilencianol.
4. El gel de poliacrilamida es mucho más delgado y frágil que el de agarosa.

Para ver si los patrones de SA fueron modificados, lo que se evalúa es la inclusión o exclusión de un exón en el ARNm maduro (los exones son las regiones del gen que están presentes en el mensajero maduro y los intrones son removidos del mensajero maduro pero están presentes en el mensajero inmaduro. No importa si codifica o no para proteína. Los exones alternativos son a veces incluidos en el mensajero maduro y a veces excluidos del mensajero maduro). El exón alternativo que se analiza es EDI, parte del gen de la fibronectina humana. Este exón está bien caracterizado y se conoce su regulación. La forma de evaluar su inclusión o no es: dañar a la célula. Al cabo de un tiempo se la mata y se purifica el ARN presente, y se purifica el ARN proveniente del gen de la Fibronectina. Después se hace una retro-transcripción, en la que se obtiene ADNc a partir de ARN. Con el ADNc se hace una PCR, en este caso radio activa.
El ADNc que contenía EDI tiene mayor longitud que el ADNc que no contiene EDI ya que incluye pares de bases que el otro no, con lo cual tiene más peso, lo que implica que en la electroforesis migra menos. Es por esto que, si la luz UVC cambia los patrones de SA, cuando se compara la proporción que hay entre la cantidad ADNc con y sin EDI, entre células irradiadas con UVC y células sin irradiar, la relación debería ser mayor en las irradiadas, que es lo que ocurre.

Como esta expresado en el paper, el splicing –sea alternativo o no- es una modificación co-transcripcional, es decir que la transcripción y el splicing son procesos acoplados (se influencian mutuamente). Lo que observaron es que luego del tratamiento de las células con luz UVC la enzima que transcribe los genes (ARNpol II) se hiperfosforila por acción de la enzima quinasa CDK-9. Este cambio en la pol II provoca que la enzima transcriba los genes pero de manera más lenta y esto, dado que la transcripción y el SA son mecanismos acoplados, afecta los patrones de inclusión-exclusión de EDI. Es por esto que cada vez que se irradia a las células, lo que se evalúa es la inclusión/exclusión de EDI y la proporción entre ARNpol II hiperfosforilada (ARNpol IIO) y ARNpol II hipofosforilada (ARNpol IIA). Así, un aumento en la inclusión de EDI viene acompañado de un aumento en la concentración de ARNpol IIO.

Por otra parte Manu quiere investigar el efecto de la luz UVB sobre el SA. Este tipo de luz tiene menor energía que la UVC pero se filtra de la capa de ozono, mientras que la UVC también lo hace pero en mucha menor proporción. Lo que hicimos fue irradiar células de la piel, queratinocitos, con luz UVC y UVB, para evaluar cual era la reacción de las células, si el patrón de SA era modificado o no. Lo que Manu iba a hacer era matar a las células 2-3 hs después de haber sido irradiadas, purificar el ARN presente, sintetizar ADNc y evaluar, mediante una PCR radioactiva, la proporción de inclusión-exclusión de EDI. En paralelo va a analizar, mediante una electroforesis pero de proteínas y no de AND, el nivel de fosforilación de la ARN pol II.

Tecnica de PCR

PCR:

La técnica de PCR-reacción en cadena de la polimerasa-es una de las técnicas más utilizada en biología molecular, que sirve para aumentar la cantidad de moléculas de ADN de una secuencia específica. Se basa en utilizar la reacción de polimerización de la ADNpol, presente en todos los seres vivos. Es un procedimiento sumamente fácil y practico, hasta existe maquinas hacen esta reacción que consta de los siguientes pasos:

1. Poner en un tubo el ADN de interés, dNTPs, Primers, taqPolimerasa (T° optima= 72°C), Mg⁺² y buffer^.
2. llevar a 95°C, 1’.
3. llevar a 60°C, 1’.
4. llevar a 72°C, 2’.
5. repetir, 2-3-4, las veces deseadas, generalmente 1h.

Lo que sucede es que a 95°C el ADN se desnaturaliza, los puentes de hidrogeno que une las dos hebras se rompen y quedan las hebras por separada, dejando las bases nitrogenadas desapareadas. A 60°C los primers se pueden unir a al ADN. A 72°C la Taq Polimerasa actúa, polimerizando el ADN obteniendo copias. Sirve para amplificar una secuencia específica, que es la que esta encerrada entre los primers. Es tan efectiva esta técnica de amplificación que al finalizar los ciclos la cantidad de moléculas es:

x.2ⁿ

siendo x el numero de moléculas iniciales, y n los ciclos. Suponiendo que partimos de 1 sola moléculas y hacemos 30 ciclos, aproximadamente 1.30 hs, al final obtenemos 1.073.741.824 moléculas de ADN

Puede ser o no radioactiva, según los que se quiere analizar. Si se quiere conocer cual era la cantidad inicial que había de ese fragmento se la hace radioactiva, para poder medir la cantidad de radioactividad, que es proporcional a la cantidad de ADN, mas radioactividad implica mayor cantidad de ADN. También sirve si es radioactiva para poder tener una cuantificación mas precisa.

aca les dejo un video que esta bueno. Eesta en ingles pero es facil de entender

Semana 3 28/5

Hoy 28/5 fuimos al laboratorio, y Manuel nos contó que necesitaba calcular la concentración de los plásmidos que habíamos resuspendido la semana pasada. Para lo cual usamos dos métodos: por fluorescencia y por electroforesis en gel de agarosa.

IMPORTANTE: AMBOS PROCEDIMIENTOS FUER REALIZADOS CON GUANTES DE LATEX POR NUESTRO CUIDADO Y PARA NO CONTAMINAR LAS MUESTRAS

Fluorescencia: esta técnica consiste en que el ADN se combina con una sustancia que cuando es irradiada por luz UV, emite fluorescencia. Entonces la fluorescencia es proporcional al ADN presente en la muestra

1. Hicimos una dilución 1:40 (1λ: 40λ) de la soluciones de plásmidos re suspendidos.

1. a la dilución le agregamos un buffer el reactivo que emite fluorescencia. Estos venían en un pack de la empresa Invitrogen.
2. también pusimos reactivo en un muestra que tenia 0ng, y otra que tenia 1000ng que es el máximo para este método, también estaban en el pack.
3. Luego calibramos el equipo Quibit, que es un medidor de fluorescencia, con la muestra de 0ng y 1000ng de ADN para indicar el máximo y el mínimo de fluorescencia aceptable.
4. Una vez calibrado el equipo procedimos a medir la concentración de las muestras de nuestros plásmidos.

Los resultados fueron:

VP16	2,5μg/μl
α-globina	0,6μg/μl
pBS	1,5μg/μl

Electroforesis: esta técnica usa dos propiedades del ADN. La primera es que a pH=7, debido a que los grupos fosfatos de los nucleótidos están desprotonados, están con carga negativa, lo que confiere carga negativa a toda la molécula. La otra propiedad que usa esta técnica es que existen distintos fragmentos de ADN, de distinta longitud de pares de bases, con lo cual cada fragmento tiene diferente peso.

Lo que se hizo fue:

1. Prepara un gel de agarosa 1%:
• En un erlenmeyer poner 1,50 g de agarosa,
• Agregar 150 ml de TAE 1X(buffer)
• Llevar a fundir a microonda 2 minutos(aprox.)
• Enfriar bajo canilla hasta poder tocarlo
• Agregar 12 μl de Bromuro de Etidio(sustancia reveladora)
• Poner en la cuba de Electroforesis, con los peines.
• Dejar gelificando.

El Bromuro de etidio es revelador ya que se intercala entres loas bases, y cuando se lo ve con luz UV emite fluorescencia anaranjada. Cuanto mas ADN presente, mayor la intensidad de la luz de la banda. Tiene potencial carcinógeno, por esto es que trabajamos con guantos en esta sustancia.

2. Mientras gelificaba la agarosa preparamos las muestras de la siguiente manera:
• Con las concentraciones obtenidas de plásmidos con el Quibit, calculamos el volumen en el que estarán presentes 100 μg de plásmido
• Como el volumen de siembra debe ser constante (10 μl), en nuevos Eppendorf pusimos volúmenes de agua para que, este con el volumen de plásmidos sea de 9μl (9 y no 10 porque después le agregamos 1μl de un buffer de siembra.)
• A los tubos con agua le agregamos los volúmenes calculados para que haya 100μg de plásmidos.
• Luego le agregamos a todos 1μl de buffer de siembra, que consiste en un colorante que sirve para: aumentar la densidad de la solución, para que se quede en el posillo y no flotando en el buffer de corrida, y es un colorante que corre como el ADN, con lo cual es una aproximación para saber por donde esta el ADN.

3. Una vez sólido el gel de agarosa, llenamos la cuba con el Buffer de corrida ( TAE1X), luego retiramos los peines. Los peines sirven para formar los posillos donde va a ir la muestra a sembrar.
4. Sembramos los 10μl del preparado de los plásmidos en 2, se siembra del lado negativo, porque el ADN va al positivo.
5. serramos la cuba, pusimos 100V y 100mA. Durante 25 minutos.
6. revelamos con UV, vimos que estaba todo bien
7. fuimos al cuarto de revelado para poder imprimir una foto de las bandas

De ser correcta la concentración arrojada por el Quibit, tuvimos que haber sembrado 100 μg de plasmido, con lo cual, cuando se divida en las bandas, la suma de los pesos de las bandas, tomando al marker como peso de referencia, debería ser igual a 100.

Y eso fue lo que vimos

Semana 2 21/5

El jueves 21/5 llegamos, charlamos y resuspendimos plásmidos que Manuel había obtenido el día anterior.
Luego de resuspender los plásmidos, preparamos un gel de agarosa 1% para poder hacer una electroforesis con el objetivo de conocer la concentración aproximada de los plásmidos. Al gel le agregamos bromuro de etidio para poder revelar luego con luz UV la electroforesis. Una vez preparado, lo dejamos gelificando y, mientras tanto, Manuel nos explicó el fundamento de esta técnica.
Después preparamos las muestras de los plásmidos resuspendidos y también preparamos las muestras de un plásmido viejo de concentración conocida. La preparación consintió en:

• tomar un volumen de plasmido resuspendido,
• agregar un pequeño volumen de un colorante(el objetivo de este es darle mas densidad a la solución para que no quede flotando en el buffer de la corrida y tener una aproximación de por donde esta el ADN ya que este colorante corre en el mismo sentido que el ADN),
• completar el volumen para llegar a un volumen en común, en este caso 10 ul
  

Todo esto lo hicimos para saber la concentración aproximada de los plásmidos para que Manuel pueda transfectar células, ya que cuando se transfectan células, la cantidad de plásmido debe ser constante ya que a la célula no le gusta que sea muy concentrado.

Paper

Aca les dejamos el Paper de la investigacion por si les interesa.

Paper

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Primer Semana 14/5

El jueves 14/5 fuimos al laboratorio de fisiología y biología molecular de FCEN, laboratorio donde vamos trabajar.

Tuvimos una charla en el departamento de Higiene y Seguridad de la facultad, sobre qué se debe hacer en caso de emergencia y los recaudos a tener en cuenta a la hora de trabajar en los laboratorios.

Después de la charla empezamos a leer el paper de nuestra investigación, con nuestro investigador para poder preguntarle las dudas que nos vayan surgiendo