Semana 16 29/10

Hoy no trabajamos, no hicimos ninugna ensayo porque empezamos a escribir la monografia, y tambein pudimos sacarnos dudas teoricas de las cosas que habiamos hecho.

Semana 15 22/10

Cuando llegamos al lab, maanu nos conto que los western de la semana pasada no le habian dado tan bien como necesitaba, porque habia levantado la muestro a las 4 horas de la irradiacion con UVC. A ese tiempo la polimerasa sufre una alta degradacion, posible caustante del "aml" resultado del western.
Por lo tanto, hoy volvimos a hacer un western, pero ahora con un control, una muestra levantada a la hora y otra muestra levantada a las dos horas y media, para 4 anticuerpos distintos(pero los mismos que la semana pasada)
Tambien empezamos a delinear como iba a ser la monografia que tenemos que presentar mas adelanta.

Semana 14 15/10

Entre todas las lineas de investigación que Manu tiene, una es entender cuales son los factores asociados a la RNA pol II y ver si estos cambian cuando esta hiperfosforilada (cuando la célula es irradiada con luz UV) o si esta hipofosforilada(en condiciones normales).
Para esto lo que va a hacer es una inmunoprecipitacion, que conciste en que un anticuerpo por un lado identifica a la Pol II, junto con sos factores asociadas, y depues ese mismo anticuerpo reconozca un peso(literalmente) y este haga que el anticuerpo junto con la RNA Pol II precipite junto con sus factores. De esta forma se "purifica" a la enzima/proteína en cuestión.
Luego mediante la espectroscopia de masa, se pude determinar que proteínas están asociadas a la pol II. Depuse se puede ver cual es la función de cada factor respecto a la velocidad de elongación de la RNA Pol II.

para esto, manu necesita que el anticuerpo que use sea muy muy especifico, y en el western de separación de la RNA Pol II del resto de la proteína, no de manchas, y de lindo.

por eso hoy hicimos un western de la misma muestra pero con distintos anticuerpos.

la semana que viene les contamos los resultados!!

Semana 13 8/10

como vale no podia estar con nosotros, y manu llego el jueves a la tarde,
el jueves 8/10 no fuimos al lab.

mas novedades la semana que viene!!

Semana 12 1/10

Como ya les habiamos contado la semana pasada, hoy hicimos una PCR. En realidad lo que hicimos fue poner a punto una PCR para Petri, uno de los chicos del laboratorio.
Lo que hicimos fue programar en la cicladora un gradiente de temperatura para ver a cual se pegaban mejor los primers(annealing, 58ºC->68ºC) y 3 distintas concentraciones de Magnesio(50mM, 100mM y 150mM , para ver cual era la que mejor funcinaba y depsues mediante una electroforesis en gel de agarosa 2% ver cual era la combinacion justa. Los wells de la misma columna recibieron la misma temperatura de annealing y los wells de la misma fila tienen la misma concentracion de magnesio.
Como los productos de la PCR diferian en tan solo 20pb, hicimos un gel 2% y no 1% porque tiene mayor poder de resolucion, esto quiere decir que puede separa mejor debido a que el tamaño de los poros es mas chico.

Lo que decidimos fue que la que combiene es la que recibio 68ºC y tenia 50mM de Mg, dado que al haber recivido mayor temperatura aumento la especificidad del pegado de primeres, con lo cual se produce menos "basura" y como tenia 50mM la actividad de la Taq fue mas especifica.

Hasta la semana que viene!

Semana 11 24/9

esta semana seguimos con vale, y lo que hicimos fue ver al microscopio las celulas de la tincion de la semana pasada
Dado que el colorante emite fluorescencia con luz UV, fuimos al microscopio de fluorescencia para verlas.
se podia distinguir los nucleos de las celulas.
la semana que viene con Vale vamos a hacer una PCR, y su revelado

hasta la semana que viene!

Semana 10 17/9

Hoy lo que hicimos fue realizar todos los pasos de una tincion especial para ver si nuestra población de células estaba contaminada con micoplasma, hongos o levadura.
Esta es la tincion de Hoechst, el cual es un compuesto que se intercala en el ADN, y emite fluorescencia a cierta longitud de onda. A la hora de revelar la tincion, en el miscropio se vera, una zona de densa coloración que sera el núcleo, y otros puntos de luminiscencia que serán las mitocndrias y en menor tamaño serán los contaminantes. No llegamos a revelar la tincion por cuestiones de tiempo

También vale nos enseño a usar la cámara de Neubauer. Esta cámara es un portaobjeto que tiene una grilla hecha y permite contar facilmente las células. El numero contado por diez a la cuarta, es la cantiad de células que hay en un mililitro de medio.

la semana que viene les contamos como nos fue con la tincion