Semana 6 18/6

El jueves 18/6 lo que hicimos fue una electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas, con la intención de realizar un Westernblot después. El Westernblot consiste en la identificación de una proteína, utilizando la electroforesis en poliacrilamida como método separativo en una mezcla de proteínas. Luego de la electroforesis lo que se hace es transferir las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. A la membrana se le agrega una solución de un anticuerpo específico para esa proteína. Lo particular del anticuerpo es que tiene adherido una enzima, que con su sustrato correspondiente libera luminiscencia, que será proporcional con la cantidad de proteína presente. Con la cual, el Western blot es tanto un método cuantitativo como cualitativo

La electroforesis en gel de poliacrilamida tiene la particularidad de ser vertical. Con la cual cuando se siembra la muestra, puede que no entre al mismo tiempo en el gel, con lo cual corrida daría con error. Para esto lo que se hace es prepara un gel concentrador que es poliacrilamida. La proteínas primero entran en contacto con el gel concentrador y después con el separador y de esta forma entran todas al mismo tiempo.

Otra particularidad para la electroforesis en poliacrilamida de proteínas, es que se las debe desnaturalizar, para que la carga y forma no sean una variable a la hora del avance y el peso sea lo único que determina cuanto migra la muestra. Para esto se le agrega un detergente, el SDS o dodecilsulfato de sodio; su función es cargar todas las proteínas negativamente y además rompe uniones no covalentes dentro de las cadenas polipeptídicas y de esta forma las desnaturaliza.

Gel concentrador: 3ml finales

• agua destilada: 2,1 ml
• acrilamida mix 30%: 0,5 ml
• 1M tris(pH 6,8): 0,38
• SDS 10%: 0,03
• APS 10%: 0,03
• Temed :0,03
  

Gel Separador 6%: 10ml

• Agua: 5,3
• Acrilamida 30%: 2 ml
• 1,5M tris(pH8,8) 2,5 ml
• SDS 10%: 0,1ml
• APS 10%: 0,1ml
• Temed :0,008ml

El APS y el Temed, son para desencadenar la polimerizacion de la acrilamida
Cuanto mas concentrado el gel, mas finos son los poros, lo que significa mas resolucion del gel. Es decir, puede separa mejor las cosas pro su tamaño

Semana 5 11/6

Como a manu algunos experimentos le dieron menor cantidad, decidió ver si plasmidos de VP16 nuevo, estaba bien y había solo plasmido, o había otras cosas.
Para esto lo que hicimos fue hacer una restricción de un plasmidos viejo de VP16 que si sabemos que es el plasmido solo una restricción del plasmido nuevo. Para ahcer la restricción lo que hicimos fue cortar los plamidos con 3 enzimas de restricción diferentes, para poder tener mas comparaciones.
lo que hicimos fue:

1. Poner un un tubo el volumen en el que halla 1,5 ug de plasmido(x3para el viejo y para el nuevo)
   
2. poner 2 ul del Buffer, correspondiente a cada enzima, en cada tubo(uno nuevo y uno viejo)
3. poner un volumen de agua destilada para llegar a 20ul finales
   
4. poner 1ul de enzima, una enzima por tubo. Las enzimas usadas fueron Eco RI, BanHI y XhoI.
5. llevar a incubar a 37ºC por 1h

luego para poder ver en cuantos fragmentos se cortaban los palsmidos, hicimos una electroforesis en gel de agarosa 1%. Si el plasmido nuevo tiene solo el plasmido de VP16, las bandas que aparecen en la electroforesis debería ser igual entre el viejo y el nuevo cortados con la misma enzima. Pero si parecen bandas que no coinciden con las del plasmido viejo, significa que hay algún contaminante.
No pudimos ver el resultado de esta electroforesis porque no llegábamos con el timepo.
Manu tampoco puedo analizar los resultados de la electroforesis en poiliacrilamida de la semana pasada y tampoco pudo analizar los resultados del daño con UVB de la semana pasada.
Así que la semana que viene les traemos todos los resultado!!

Mapa de Restriccion

Aca les dejo el mapa de restriccion del plasmido pBR322
pBR322

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Enzimas de Restriccion y plasmidos

Las Enzimas de restricción, son enzimas que tienen las bacterias cuya función es defender su propio material genético ante la aparición de otro ADN proveniente, por ejemplo, de un fago. Lo que hacen, es cortar el ADN en una secuencia especifica, no aleatoriamente. Esas secuencias especificas de corte de las enzimas de restricción (ER) se llaman sitios de restricción. Esta especificidad es lo que las hacen útiles en biología molecular, siendo las tijeras moleculares. Las ER pueden cortar de forma escalonada, o recta.

Los plasmidos son ADN circular extracromosomico que tienen las bacterias. No tienen genes básicos para la vida de las bacterias, generalmente tienen genes que codifican para una resistencia a antibióticos. Gracias a q son chicos, son los vectores de genes chicos por excelencia. Definimos vector como molécula chica de ADN capaz de introducir una secuencia de interés dentro de un huésped. Principalmente debe poder replicarse independiente del ADN del huésped. Un mapa de restricción es una mapa de todos los lugares del plasmidos donde es cortado por las diferentes ER

Sabiendo el sitio de restricción de la ER de interés, y teniendo un mapa de restricción del plasmido utilizado se puede de esta forma, cortar el plasmido dejándolo habierto, y en esa apertura se puede introducir la secuencia de interés.
Combinado estas dos herramientas se puede introducir un secuencia de interés, por ejemplo el gen de la insulina, dentro de una bacteria y que esta bacteria produzca insulina. Luego esta insulina se puede purificar y comercializar.

Acá les dejo un cuadro, con algunas enzimas de restricción.

cuadro de ER

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Semana 4 4/6

Una de las preguntas que Manu intenta responder es si los cambios que observa en los patrones de SA, y que favorecen la apoptosis, se dan también cuando la vía apoptótica esta inhibida. Para esto, nos comentó que había hecho una PCR radioactiva sobre un ADNc obtenido a partir de ARN extraído de células irradiadas con luz UVC pero con el mecanismo apoptótico inhibido. Para analizar lo ocurrido con la PCR radioactiva realizamos una electroforesis en geles de poliacrilamida (en poliacrilamida y no en agarosa, porque la poliacrilamida permite luego el revelado en placas fotográficas, permitiendo una mejor cuantificación de los productos de PCR).

No pudimos ver el resultado ya que tardaba 1 hora en terminar la corrida, y nos fuimos antes de terminarla. Así que la semana que viene Manuel nos va a contar cuales fueron los resultados

Gel de poliacrilamida:

1. TBE
2. Acrilamida
3. Bisacrilamida
4. Temed, tretametil-etilendiamina
5. Persulfato de amonio

El temed y el persulfato de amonio, son los catalizadores por radicales libres de la polimerización de la acrilamida/bisacrilamida.

Respecto al procedimiento de la electroforesis en gel de poliacrilamida, es prácticamente igual que una en gel de agarosa excepto que:

1. La corrida se hace de forma vertical y no horizontal.
2. El buffer de corrida no es TAE (tris-acetato-EDTA) sino TBE (tris-borato-EDTA), el cual tiene una mayor capacidad reguladora.
3. El buffer de siembra tiene además de glicerol y azul de bromofenol otro colorante más que es el xilencianol.
4. El gel de poliacrilamida es mucho más delgado y frágil que el de agarosa.

Para ver si los patrones de SA fueron modificados, lo que se evalúa es la inclusión o exclusión de un exón en el ARNm maduro (los exones son las regiones del gen que están presentes en el mensajero maduro y los intrones son removidos del mensajero maduro pero están presentes en el mensajero inmaduro. No importa si codifica o no para proteína. Los exones alternativos son a veces incluidos en el mensajero maduro y a veces excluidos del mensajero maduro). El exón alternativo que se analiza es EDI, parte del gen de la fibronectina humana. Este exón está bien caracterizado y se conoce su regulación. La forma de evaluar su inclusión o no es: dañar a la célula. Al cabo de un tiempo se la mata y se purifica el ARN presente, y se purifica el ARN proveniente del gen de la Fibronectina. Después se hace una retro-transcripción, en la que se obtiene ADNc a partir de ARN. Con el ADNc se hace una PCR, en este caso radio activa.
El ADNc que contenía EDI tiene mayor longitud que el ADNc que no contiene EDI ya que incluye pares de bases que el otro no, con lo cual tiene más peso, lo que implica que en la electroforesis migra menos. Es por esto que, si la luz UVC cambia los patrones de SA, cuando se compara la proporción que hay entre la cantidad ADNc con y sin EDI, entre células irradiadas con UVC y células sin irradiar, la relación debería ser mayor en las irradiadas, que es lo que ocurre.

Como esta expresado en el paper, el splicing –sea alternativo o no- es una modificación co-transcripcional, es decir que la transcripción y el splicing son procesos acoplados (se influencian mutuamente). Lo que observaron es que luego del tratamiento de las células con luz UVC la enzima que transcribe los genes (ARNpol II) se hiperfosforila por acción de la enzima quinasa CDK-9. Este cambio en la pol II provoca que la enzima transcriba los genes pero de manera más lenta y esto, dado que la transcripción y el SA son mecanismos acoplados, afecta los patrones de inclusión-exclusión de EDI. Es por esto que cada vez que se irradia a las células, lo que se evalúa es la inclusión/exclusión de EDI y la proporción entre ARNpol II hiperfosforilada (ARNpol IIO) y ARNpol II hipofosforilada (ARNpol IIA). Así, un aumento en la inclusión de EDI viene acompañado de un aumento en la concentración de ARNpol IIO.

Por otra parte Manu quiere investigar el efecto de la luz UVB sobre el SA. Este tipo de luz tiene menor energía que la UVC pero se filtra de la capa de ozono, mientras que la UVC también lo hace pero en mucha menor proporción. Lo que hicimos fue irradiar células de la piel, queratinocitos, con luz UVC y UVB, para evaluar cual era la reacción de las células, si el patrón de SA era modificado o no. Lo que Manu iba a hacer era matar a las células 2-3 hs después de haber sido irradiadas, purificar el ARN presente, sintetizar ADNc y evaluar, mediante una PCR radioactiva, la proporción de inclusión-exclusión de EDI. En paralelo va a analizar, mediante una electroforesis pero de proteínas y no de AND, el nivel de fosforilación de la ARN pol II.

Tecnica de PCR

PCR:

La técnica de PCR-reacción en cadena de la polimerasa-es una de las técnicas más utilizada en biología molecular, que sirve para aumentar la cantidad de moléculas de ADN de una secuencia específica. Se basa en utilizar la reacción de polimerización de la ADNpol, presente en todos los seres vivos. Es un procedimiento sumamente fácil y practico, hasta existe maquinas hacen esta reacción que consta de los siguientes pasos:

1. Poner en un tubo el ADN de interés, dNTPs, Primers, taqPolimerasa (T° optima= 72°C), Mg⁺² y buffer^.
2. llevar a 95°C, 1’.
3. llevar a 60°C, 1’.
4. llevar a 72°C, 2’.
5. repetir, 2-3-4, las veces deseadas, generalmente 1h.

Lo que sucede es que a 95°C el ADN se desnaturaliza, los puentes de hidrogeno que une las dos hebras se rompen y quedan las hebras por separada, dejando las bases nitrogenadas desapareadas. A 60°C los primers se pueden unir a al ADN. A 72°C la Taq Polimerasa actúa, polimerizando el ADN obteniendo copias. Sirve para amplificar una secuencia específica, que es la que esta encerrada entre los primers. Es tan efectiva esta técnica de amplificación que al finalizar los ciclos la cantidad de moléculas es:

x.2ⁿ

siendo x el numero de moléculas iniciales, y n los ciclos. Suponiendo que partimos de 1 sola moléculas y hacemos 30 ciclos, aproximadamente 1.30 hs, al final obtenemos 1.073.741.824 moléculas de ADN

Puede ser o no radioactiva, según los que se quiere analizar. Si se quiere conocer cual era la cantidad inicial que había de ese fragmento se la hace radioactiva, para poder medir la cantidad de radioactividad, que es proporcional a la cantidad de ADN, mas radioactividad implica mayor cantidad de ADN. También sirve si es radioactiva para poder tener una cuantificación mas precisa.

aca les dejo un video que esta bueno. Eesta en ingles pero es facil de entender