Hoy 28/5 fuimos al laboratorio, y Manuel nos contó que necesitaba calcular la concentración de los plásmidos que habíamos resuspendido la semana pasada. Para lo cual usamos dos métodos: por fluorescencia y por electroforesis en gel de agarosa.
IMPORTANTE: AMBOS PROCEDIMIENTOS FUER REALIZADOS CON GUANTES DE LATEX POR NUESTRO CUIDADO Y PARA NO CONTAMINAR LAS MUESTRAS
Fluorescencia: esta técnica consiste en que el ADN se combina con una sustancia que cuando es irradiada por luz UV, emite fluorescencia. Entonces la fluorescencia es proporcional al ADN presente en la muestra
- Hicimos una dilución 1:40 (1λ: 40λ) de la soluciones de plásmidos re suspendidos.
- a la dilución le agregamos un buffer el reactivo que emite fluorescencia. Estos venían en un pack de la empresa Invitrogen.
- también pusimos reactivo en un muestra que tenia 0ng, y otra que tenia 1000ng que es el máximo para este método, también estaban en el pack.
- Luego calibramos el equipo Quibit, que es un medidor de fluorescencia, con la muestra de 0ng y 1000ng de ADN para indicar el máximo y el mínimo de fluorescencia aceptable.
- Una vez calibrado el equipo procedimos a medir la concentración de las muestras de nuestros plásmidos.
Los resultados fueron:
| VP16 | 2,5μg/μl |
| α-globina | 0,6μg/μl |
| pBS | 1,5μg/μl |
Electroforesis: esta técnica usa dos propiedades del ADN. La primera es que a pH=7, debido a que los grupos fosfatos de los nucleótidos están desprotonados, están con carga negativa, lo que confiere carga negativa a toda la molécula. La otra propiedad que usa esta técnica es que existen distintos fragmentos de ADN, de distinta longitud de pares de bases, con lo cual cada fragmento tiene diferente peso.
Lo que se hizo fue:
- Prepara un gel de agarosa 1%:
- En un erlenmeyer poner
- Agregar 150 ml de TAE 1X(buffer)
- Llevar a fundir a microonda 2 minutos(aprox.)
- Enfriar bajo canilla hasta poder tocarlo
- Agregar 12 μl de Bromuro de Etidio(sustancia reveladora)
- Poner en la cuba de Electroforesis, con los peines.
- Dejar gelificando.
El Bromuro de etidio es revelador ya que se intercala entres loas bases, y cuando se lo ve con luz UV emite fluorescencia anaranjada. Cuanto mas ADN presente, mayor la intensidad de la luz de la banda. Tiene potencial carcinógeno, por esto es que trabajamos con guantos en esta sustancia.
- Mientras gelificaba la agarosa preparamos las muestras de la siguiente manera:
- Con las concentraciones obtenidas de plásmidos con el Quibit, calculamos el volumen en el que estarán presentes 100 μg de plásmido
- Como el volumen de siembra debe ser constante (10 μl), en nuevos Eppendorf pusimos volúmenes de agua para que, este con el volumen de plásmidos sea de 9μl (9 y no 10 porque después le agregamos 1μl de un buffer de siembra.)
- A los tubos con agua le agregamos los volúmenes calculados para que haya 100μg de plásmidos.
- Luego le agregamos a todos 1μl de buffer de siembra, que consiste en un colorante que sirve para: aumentar la densidad de la solución, para que se quede en el posillo y no flotando en el buffer de corrida, y es un colorante que corre como el ADN, con lo cual es una aproximación para saber por donde esta el ADN.
- Una vez sólido el gel de agarosa, llenamos la cuba con el Buffer de corrida ( TAE1X), luego retiramos los peines. Los peines sirven para formar los posillos donde va a ir la muestra a sembrar.
- Sembramos los 10μl del preparado de los plásmidos en 2, se siembra del lado negativo, porque el ADN va al positivo.
- serramos la cuba, pusimos 100V y 100mA. Durante 25 minutos.
- revelamos con UV, vimos que estaba todo bien
- fuimos al cuarto de revelado para poder imprimir una foto de las bandas
De ser correcta la concentración arrojada por el Quibit, tuvimos que haber sembrado 100 μg de plasmido, con lo cual, cuando se divida en las bandas, la suma de los pesos de las bandas, tomando al marker como peso de referencia, debería ser igual a 100.
Y eso fue lo que vimos
