Hoy lo que hicimos fue realizar todos los pasos de una tincion especial para ver si nuestra población de células estaba contaminada con micoplasma, hongos o levadura.
Esta es la tincion de Hoechst, el cual es un compuesto que se intercala en el ADN, y emite fluorescencia a cierta longitud de onda. A la hora de revelar la tincion, en el miscropio se vera, una zona de densa coloración que sera el núcleo, y otros puntos de luminiscencia que serán las mitocndrias y en menor tamaño serán los contaminantes. No llegamos a revelar la tincion por cuestiones de tiempo
También vale nos enseño a usar la cámara de Neubauer. Esta cámara es un portaobjeto que tiene una grilla hecha y permite contar facilmente las células. El numero contado por diez a la cuarta, es la cantiad de células que hay en un mililitro de medio.
la semana que viene les contamos como nos fue con la tincion
lunes, 21 de septiembre de 2009
Semana 9 10/9
Como el Dr. Muñoz se fue a Europa a una seria de conferencias y meetings, por el mes de Septiembre vamos a estar con la Dra Valeria Buggian, que es la encargada del cuarto de cultivo para el grupo ARK.
El jueves 9/10 vale nos explico en consiste su trabajo. Después fuimos al cuarto de cultivo, nos explico el funcionamiento en general del cuarto, y las responsabilidades.
También, vale habia preparado unas placas con células para que nos encarguemos por este mes de su mantenimiento. Entonces, ese jueves lo que hicimos fue hacer un pasaje. Este pasaje consiste en primero ver en que esta están las células de la plica, es decir cuantas células, aproximadamente, hay en la placa. Esto se hace para saber, mas o menos que dilución hay que hacer. Una vez que sabes cuantas células hay, se retira el medio, se lo lava con PBS (una solución isotónica, se retira el PBS, se agrega tripsina que sirve para que las células se despegan de las proteínas que están haciendo de matriz extracelular. Esperamos unos minutos, le agregamos un poco de medio que tiene proteínas bobinas y tomamos la alícuotas deseadasegún la dilución que queramos hacer.
El jueves 9/10 vale nos explico en consiste su trabajo. Después fuimos al cuarto de cultivo, nos explico el funcionamiento en general del cuarto, y las responsabilidades.
También, vale habia preparado unas placas con células para que nos encarguemos por este mes de su mantenimiento. Entonces, ese jueves lo que hicimos fue hacer un pasaje. Este pasaje consiste en primero ver en que esta están las células de la plica, es decir cuantas células, aproximadamente, hay en la placa. Esto se hace para saber, mas o menos que dilución hay que hacer. Una vez que sabes cuantas células hay, se retira el medio, se lo lava con PBS (una solución isotónica, se retira el PBS, se agrega tripsina que sirve para que las células se despegan de las proteínas que están haciendo de matriz extracelular. Esperamos unos minutos, le agregamos un poco de medio que tiene proteínas bobinas y tomamos la alícuotas deseadasegún la dilución que queramos hacer.
jueves, 3 de septiembre de 2009
Semana 8 3/9
El jueves 20/8 y 27/8 mati y yo estábamos en bariloche, con lo cual no fuimos al laboratorio.
Lo que hicimos hoy fue extraer y purificar ARN de dos lineas celular, que habían sido tratadas con luz UVC y UVB, con su correspondiente control.
Lo que se hizo fue poner a las células en un medio con Fenol y acetato de sodio, para destruir las mebranas y distintos componentes celulares. Luego se recogen las celulas en un tubo eppendorff y se le agregan 0.2ml de cloroformo, cuya función es ayudar a destruir y a separa en dos fases(ya que es menos polar que el fenol)
Después se mezcla y se centrifuga, lo que genera 2 fases una acuosa y otra orgánica. A nosotros nos interesa la fase acuosa, polar, ya que el ARN es polar. A la fase acusa se la agrega 0.5ml de isopropanol lo que baja la polaridad del medio, generando que el ARN precipite. Después de dejarlo a temperatura ambiente por 20 min se lo centrifuga a 12.000G por 10 min. Cuando se retiran los tubos de la centrifuga se ve en el fondo un precipitado(pellet) que esta fuertemente agarrada al tubo. Se descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de etanol 70% y se centrifuga a 7600g por 5 min. Se descarta el sobrenadante, con cuidado ya que la polaridad del etanol 70% es bastante intermedia y el ARN es parcialmente soluble en el mismo.Una vez descartado el sobrenadante se dejan los tubos abiertos para que se evapore lo que haya quedado de etanol.Una vez seco se le agregan 1.5-2ml de agua
Por ultimo se llevan los tubos a -80ºC por 5 min, después a 55ºC por 5 min y se vortexea.
finalmente tenemos al ARN, supuestamente puro.
Hay que destacar que lo mas complicado de una extracción no es la extracción en si mismo si no que es la predicación, extraer solamente lo de interés y no lo que es parecido, como puede ser el ADN. Es por eso que se juega con la polaridad del medio, ya que el ADN es menos polar que el ARN ya que cuenta con un OH menos(ácido DESOXIribonucleico)
Esta extracción y purifican viene seguida de una retrotranscripcion, un PCR radiactiva, y una electroforesis en poliacrilamida.
La semana que viene Manu se va a dar unas charlas por eruopa, con lo que no vamos a tener pasantia hasta el 8 de octubre. a la vuelte les traemos novedades
saludos
Lo que hicimos hoy fue extraer y purificar ARN de dos lineas celular, que habían sido tratadas con luz UVC y UVB, con su correspondiente control.
Lo que se hizo fue poner a las células en un medio con Fenol y acetato de sodio, para destruir las mebranas y distintos componentes celulares. Luego se recogen las celulas en un tubo eppendorff y se le agregan 0.2ml de cloroformo, cuya función es ayudar a destruir y a separa en dos fases(ya que es menos polar que el fenol)
Después se mezcla y se centrifuga, lo que genera 2 fases una acuosa y otra orgánica. A nosotros nos interesa la fase acuosa, polar, ya que el ARN es polar. A la fase acusa se la agrega 0.5ml de isopropanol lo que baja la polaridad del medio, generando que el ARN precipite. Después de dejarlo a temperatura ambiente por 20 min se lo centrifuga a 12.000G por 10 min. Cuando se retiran los tubos de la centrifuga se ve en el fondo un precipitado(pellet) que esta fuertemente agarrada al tubo. Se descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de etanol 70% y se centrifuga a 7600g por 5 min. Se descarta el sobrenadante, con cuidado ya que la polaridad del etanol 70% es bastante intermedia y el ARN es parcialmente soluble en el mismo.Una vez descartado el sobrenadante se dejan los tubos abiertos para que se evapore lo que haya quedado de etanol.Una vez seco se le agregan 1.5-2ml de agua
Por ultimo se llevan los tubos a -80ºC por 5 min, después a 55ºC por 5 min y se vortexea.
finalmente tenemos al ARN, supuestamente puro.
Hay que destacar que lo mas complicado de una extracción no es la extracción en si mismo si no que es la predicación, extraer solamente lo de interés y no lo que es parecido, como puede ser el ADN. Es por eso que se juega con la polaridad del medio, ya que el ADN es menos polar que el ARN ya que cuenta con un OH menos(ácido DESOXIribonucleico)
Esta extracción y purifican viene seguida de una retrotranscripcion, un PCR radiactiva, y una electroforesis en poliacrilamida.
La semana que viene Manu se va a dar unas charlas por eruopa, con lo que no vamos a tener pasantia hasta el 8 de octubre. a la vuelte les traemos novedades
saludos
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