El jueves 18/6 lo que hicimos fue una electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas, con la intención de realizar un Westernblot después. El Westernblot consiste en la identificación de una proteína, utilizando la electroforesis en poliacrilamida como método separativo en una mezcla de proteínas. Luego de la electroforesis lo que se hace es transferir las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. A la membrana se le agrega una solución de un anticuerpo específico para esa proteína. Lo particular del anticuerpo es que tiene adherido una enzima, que con su sustrato correspondiente libera luminiscencia, que será proporcional con la cantidad de proteína presente. Con la cual, el Western blot es tanto un método cuantitativo como cualitativo
La electroforesis en gel de poliacrilamida tiene la particularidad de ser vertical. Con la cual cuando se siembra la muestra, puede que no entre al mismo tiempo en el gel, con lo cual corrida daría con error. Para esto lo que se hace es prepara un gel concentrador que es poliacrilamida. La proteínas primero entran en contacto con el gel concentrador y después con el separador y de esta forma entran todas al mismo tiempo.
Otra particularidad para la electroforesis en poliacrilamida de proteínas, es que se las debe desnaturalizar, para que la carga y forma no sean una variable a la hora del avance y el peso sea lo único que determina cuanto migra la muestra. Para esto se le agrega un detergente, el SDS o dodecilsulfato de sodio; su función es cargar todas las proteínas negativamente y además rompe uniones no covalentes dentro de las cadenas polipeptídicas y de esta forma las desnaturaliza.
Gel concentrador: 3ml finales
- agua destilada: 2,1 ml
- Agua: 5,3
- Acrilamida 30%: 2 ml
- 1,5M tris(pH8,8) 2,5 ml
- SDS 10%: 0,1ml
- APS 10%: 0,1ml
- Temed :0,008ml
Cuanto mas concentrado el gel, mas finos son los poros, lo que significa mas resolucion del gel. Es decir, puede separa mejor las cosas pro su tamaño
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