Semana 4 4/6

Una de las preguntas que Manu intenta responder es si los cambios que observa en los patrones de SA, y que favorecen la apoptosis, se dan también cuando la vía apoptótica esta inhibida. Para esto, nos comentó que había hecho una PCR radioactiva sobre un ADNc obtenido a partir de ARN extraído de células irradiadas con luz UVC pero con el mecanismo apoptótico inhibido. Para analizar lo ocurrido con la PCR radioactiva realizamos una electroforesis en geles de poliacrilamida (en poliacrilamida y no en agarosa, porque la poliacrilamida permite luego el revelado en placas fotográficas, permitiendo una mejor cuantificación de los productos de PCR).

No pudimos ver el resultado ya que tardaba 1 hora en terminar la corrida, y nos fuimos antes de terminarla. Así que la semana que viene Manuel nos va a contar cuales fueron los resultados

Gel de poliacrilamida:

1. TBE
2. Acrilamida
3. Bisacrilamida
4. Temed, tretametil-etilendiamina
5. Persulfato de amonio

El temed y el persulfato de amonio, son los catalizadores por radicales libres de la polimerización de la acrilamida/bisacrilamida.

Respecto al procedimiento de la electroforesis en gel de poliacrilamida, es prácticamente igual que una en gel de agarosa excepto que:

1. La corrida se hace de forma vertical y no horizontal.
2. El buffer de corrida no es TAE (tris-acetato-EDTA) sino TBE (tris-borato-EDTA), el cual tiene una mayor capacidad reguladora.
3. El buffer de siembra tiene además de glicerol y azul de bromofenol otro colorante más que es el xilencianol.
4. El gel de poliacrilamida es mucho más delgado y frágil que el de agarosa.

Para ver si los patrones de SA fueron modificados, lo que se evalúa es la inclusión o exclusión de un exón en el ARNm maduro (los exones son las regiones del gen que están presentes en el mensajero maduro y los intrones son removidos del mensajero maduro pero están presentes en el mensajero inmaduro. No importa si codifica o no para proteína. Los exones alternativos son a veces incluidos en el mensajero maduro y a veces excluidos del mensajero maduro). El exón alternativo que se analiza es EDI, parte del gen de la fibronectina humana. Este exón está bien caracterizado y se conoce su regulación. La forma de evaluar su inclusión o no es: dañar a la célula. Al cabo de un tiempo se la mata y se purifica el ARN presente, y se purifica el ARN proveniente del gen de la Fibronectina. Después se hace una retro-transcripción, en la que se obtiene ADNc a partir de ARN. Con el ADNc se hace una PCR, en este caso radio activa.
El ADNc que contenía EDI tiene mayor longitud que el ADNc que no contiene EDI ya que incluye pares de bases que el otro no, con lo cual tiene más peso, lo que implica que en la electroforesis migra menos. Es por esto que, si la luz UVC cambia los patrones de SA, cuando se compara la proporción que hay entre la cantidad ADNc con y sin EDI, entre células irradiadas con UVC y células sin irradiar, la relación debería ser mayor en las irradiadas, que es lo que ocurre.

Como esta expresado en el paper, el splicing –sea alternativo o no- es una modificación co-transcripcional, es decir que la transcripción y el splicing son procesos acoplados (se influencian mutuamente). Lo que observaron es que luego del tratamiento de las células con luz UVC la enzima que transcribe los genes (ARNpol II) se hiperfosforila por acción de la enzima quinasa CDK-9. Este cambio en la pol II provoca que la enzima transcriba los genes pero de manera más lenta y esto, dado que la transcripción y el SA son mecanismos acoplados, afecta los patrones de inclusión-exclusión de EDI. Es por esto que cada vez que se irradia a las células, lo que se evalúa es la inclusión/exclusión de EDI y la proporción entre ARNpol II hiperfosforilada (ARNpol IIO) y ARNpol II hipofosforilada (ARNpol IIA). Así, un aumento en la inclusión de EDI viene acompañado de un aumento en la concentración de ARNpol IIO.

Por otra parte Manu quiere investigar el efecto de la luz UVB sobre el SA. Este tipo de luz tiene menor energía que la UVC pero se filtra de la capa de ozono, mientras que la UVC también lo hace pero en mucha menor proporción. Lo que hicimos fue irradiar células de la piel, queratinocitos, con luz UVC y UVB, para evaluar cual era la reacción de las células, si el patrón de SA era modificado o no. Lo que Manu iba a hacer era matar a las células 2-3 hs después de haber sido irradiadas, purificar el ARN presente, sintetizar ADNc y evaluar, mediante una PCR radioactiva, la proporción de inclusión-exclusión de EDI. En paralelo va a analizar, mediante una electroforesis pero de proteínas y no de AND, el nivel de fosforilación de la ARN pol II.