Semana 9 10/9

Como el Dr. Muñoz se fue a Europa a una seria de conferencias y meetings, por el mes de Septiembre vamos a estar con la Dra Valeria Buggian, que es la encargada del cuarto de cultivo para el grupo ARK.

El jueves 9/10 vale nos explico en consiste su trabajo. Después fuimos al cuarto de cultivo, nos explico el funcionamiento en general del cuarto, y las responsabilidades.
También, vale habia preparado unas placas con células para que nos encarguemos por este mes de su mantenimiento. Entonces, ese jueves lo que hicimos fue hacer un pasaje. Este pasaje consiste en primero ver en que esta están las células de la plica, es decir cuantas células, aproximadamente, hay en la placa. Esto se hace para saber, mas o menos que dilución hay que hacer. Una vez que sabes cuantas células hay, se retira el medio, se lo lava con PBS (una solución isotónica, se retira el PBS, se agrega tripsina que sirve para que las células se despegan de las proteínas que están haciendo de matriz extracelular. Esperamos unos minutos, le agregamos un poco de medio que tiene proteínas bobinas y tomamos la alícuotas deseadasegún la dilución que queramos hacer.

Semana 8 3/9

El jueves 20/8 y 27/8 mati y yo estábamos en bariloche, con lo cual no fuimos al laboratorio.

Lo que hicimos hoy fue extraer y purificar ARN de dos lineas celular, que habían sido tratadas con luz UVC y UVB, con su correspondiente control.

Lo que se hizo fue poner a las células en un medio con Fenol y acetato de sodio, para destruir las mebranas y distintos componentes celulares. Luego se recogen las celulas en un tubo eppendorff y se le agregan 0.2ml de cloroformo, cuya función es ayudar a destruir y a separa en dos fases(ya que es menos polar que el fenol)
Después se mezcla y se centrifuga, lo que genera 2 fases una acuosa y otra orgánica. A nosotros nos interesa la fase acuosa, polar, ya que el ARN es polar. A la fase acusa se la agrega 0.5ml de isopropanol lo que baja la polaridad del medio, generando que el ARN precipite. Después de dejarlo a temperatura ambiente por 20 min se lo centrifuga a 12.000G por 10 min. Cuando se retiran los tubos de la centrifuga se ve en el fondo un precipitado(pellet) que esta fuertemente agarrada al tubo. Se descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de etanol 70% y se centrifuga a 7600g por 5 min. Se descarta el sobrenadante, con cuidado ya que la polaridad del etanol 70% es bastante intermedia y el ARN es parcialmente soluble en el mismo.Una vez descartado el sobrenadante se dejan los tubos abiertos para que se evapore lo que haya quedado de etanol.Una vez seco se le agregan 1.5-2ml de agua
Por ultimo se llevan los tubos a -80ºC por 5 min, después a 55ºC por 5 min y se vortexea.
finalmente tenemos al ARN, supuestamente puro.

Hay que destacar que lo mas complicado de una extracción no es la extracción en si mismo si no que es la predicación, extraer solamente lo de interés y no lo que es parecido, como puede ser el ADN. Es por eso que se juega con la polaridad del medio, ya que el ADN es menos polar que el ARN ya que cuenta con un OH menos(ácido DESOXIribonucleico)

Esta extracción y purifican viene seguida de una retrotranscripcion, un PCR radiactiva, y una electroforesis en poliacrilamida.

La semana que viene Manu se va a dar unas charlas por eruopa, con lo que no vamos a tener pasantia hasta el 8 de octubre. a la vuelte les traemos novedades

saludos

Semana 7 6/8

Hoy, después de un buen tiempo sin vernos, nos reencontramos con Manu.
Mati no puedo ir porque tenia que rendir un final de IPC por UBA XXI

En este periodo en el que no estuvimos, manu siguió investigando el cambio en los patrones de Splicing Alternativo en células irradiadas con luz UVB, que es la que llega a la tierra desde el sol. En ese tiempo, después de analizar resultados se dio cuenta que el cambio en lo patrones de SA en células irradiadas con luz UVC no es dependiente de la posibilidad de realizar apoptosis por parte de la célula. Y también vio que el cambio en los patrones de SA por daño con UVC no depende de esta posibilidad de morir, que se ve representada en la célula por el aumento o disminución de el factor de transcripción p53. Pero, en oposicion, para que el daño con UVB (de menor energía que la UVC)cambie los patrones del SA SI tiene que estar presente p53. En realidad esto es un leve indicio.
Por esto es que hoy irradiamos con luz UVB y UVC a unas células sin la posibilidad de aumentar la cantidad de p53 y otras que si tienen la capacidad de aumentar la cantidad de p53. La semana que viene les contamos los resultados

Esto es todo por esta semana.
En los proximos días vamos a subir la introducción que tenemos que entregar para el 19/8

Saludos

Receso

Debido a la emergencia sanitaria, no fuimos durante dos semanas a la pasantia.
A estas dos semanas se les sumaron las 2 semanas de receso invernal.
Con lo cual no fuimos a la pasantia por un mes.

Semana 6 18/6

El jueves 18/6 lo que hicimos fue una electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas, con la intención de realizar un Westernblot después. El Westernblot consiste en la identificación de una proteína, utilizando la electroforesis en poliacrilamida como método separativo en una mezcla de proteínas. Luego de la electroforesis lo que se hace es transferir las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. A la membrana se le agrega una solución de un anticuerpo específico para esa proteína. Lo particular del anticuerpo es que tiene adherido una enzima, que con su sustrato correspondiente libera luminiscencia, que será proporcional con la cantidad de proteína presente. Con la cual, el Western blot es tanto un método cuantitativo como cualitativo

La electroforesis en gel de poliacrilamida tiene la particularidad de ser vertical. Con la cual cuando se siembra la muestra, puede que no entre al mismo tiempo en el gel, con lo cual corrida daría con error. Para esto lo que se hace es prepara un gel concentrador que es poliacrilamida. La proteínas primero entran en contacto con el gel concentrador y después con el separador y de esta forma entran todas al mismo tiempo.

Otra particularidad para la electroforesis en poliacrilamida de proteínas, es que se las debe desnaturalizar, para que la carga y forma no sean una variable a la hora del avance y el peso sea lo único que determina cuanto migra la muestra. Para esto se le agrega un detergente, el SDS o dodecilsulfato de sodio; su función es cargar todas las proteínas negativamente y además rompe uniones no covalentes dentro de las cadenas polipeptídicas y de esta forma las desnaturaliza.

Gel concentrador: 3ml finales

• agua destilada: 2,1 ml
• acrilamida mix 30%: 0,5 ml
• 1M tris(pH 6,8): 0,38
• SDS 10%: 0,03
• APS 10%: 0,03
• Temed :0,03
  

Gel Separador 6%: 10ml

• Agua: 5,3
• Acrilamida 30%: 2 ml
• 1,5M tris(pH8,8) 2,5 ml
• SDS 10%: 0,1ml
• APS 10%: 0,1ml
• Temed :0,008ml

El APS y el Temed, son para desencadenar la polimerizacion de la acrilamida
Cuanto mas concentrado el gel, mas finos son los poros, lo que significa mas resolucion del gel. Es decir, puede separa mejor las cosas pro su tamaño

Semana 5 11/6

Como a manu algunos experimentos le dieron menor cantidad, decidió ver si plasmidos de VP16 nuevo, estaba bien y había solo plasmido, o había otras cosas.
Para esto lo que hicimos fue hacer una restricción de un plasmidos viejo de VP16 que si sabemos que es el plasmido solo una restricción del plasmido nuevo. Para ahcer la restricción lo que hicimos fue cortar los plamidos con 3 enzimas de restricción diferentes, para poder tener mas comparaciones.
lo que hicimos fue:

1. Poner un un tubo el volumen en el que halla 1,5 ug de plasmido(x3para el viejo y para el nuevo)
   
2. poner 2 ul del Buffer, correspondiente a cada enzima, en cada tubo(uno nuevo y uno viejo)
3. poner un volumen de agua destilada para llegar a 20ul finales
   
4. poner 1ul de enzima, una enzima por tubo. Las enzimas usadas fueron Eco RI, BanHI y XhoI.
5. llevar a incubar a 37ºC por 1h

luego para poder ver en cuantos fragmentos se cortaban los palsmidos, hicimos una electroforesis en gel de agarosa 1%. Si el plasmido nuevo tiene solo el plasmido de VP16, las bandas que aparecen en la electroforesis debería ser igual entre el viejo y el nuevo cortados con la misma enzima. Pero si parecen bandas que no coinciden con las del plasmido viejo, significa que hay algún contaminante.
No pudimos ver el resultado de esta electroforesis porque no llegábamos con el timepo.
Manu tampoco puedo analizar los resultados de la electroforesis en poiliacrilamida de la semana pasada y tampoco pudo analizar los resultados del daño con UVB de la semana pasada.
Así que la semana que viene les traemos todos los resultado!!

Mapa de Restriccion

Aca les dejo el mapa de restriccion del plasmido pBR322
pBR322

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