Como ya les habiamos contado la semana pasada, hoy hicimos una PCR. En realidad lo que hicimos fue poner a punto una PCR para Petri, uno de los chicos del laboratorio.
Lo que hicimos fue programar en la cicladora un gradiente de temperatura para ver a cual se pegaban mejor los primers(annealing, 58ºC->68ºC) y 3 distintas concentraciones de Magnesio(50mM, 100mM y 150mM , para ver cual era la que mejor funcinaba y depsues mediante una electroforesis en gel de agarosa 2% ver cual era la combinacion justa. Los wells de la misma columna recibieron la misma temperatura de annealing y los wells de la misma fila tienen la misma concentracion de magnesio.
Como los productos de la PCR diferian en tan solo 20pb, hicimos un gel 2% y no 1% porque tiene mayor poder de resolucion, esto quiere decir que puede separa mejor debido a que el tamaño de los poros es mas chico.
Lo que decidimos fue que la que combiene es la que recibio 68ºC y tenia 50mM de Mg, dado que al haber recivido mayor temperatura aumento la especificidad del pegado de primeres, con lo cual se produce menos "basura" y como tenia 50mM la actividad de la Taq fue mas especifica.
Hasta la semana que viene!
jueves, 1 de octubre de 2009
Semana 11 24/9
esta semana seguimos con vale, y lo que hicimos fue ver al microscopio las celulas de la tincion de la semana pasada
Dado que el colorante emite fluorescencia con luz UV, fuimos al microscopio de fluorescencia para verlas.
se podia distinguir los nucleos de las celulas.
la semana que viene con Vale vamos a hacer una PCR, y su revelado
hasta la semana que viene!
Dado que el colorante emite fluorescencia con luz UV, fuimos al microscopio de fluorescencia para verlas.
se podia distinguir los nucleos de las celulas.
la semana que viene con Vale vamos a hacer una PCR, y su revelado
hasta la semana que viene!
lunes, 21 de septiembre de 2009
Semana 10 17/9
Hoy lo que hicimos fue realizar todos los pasos de una tincion especial para ver si nuestra población de células estaba contaminada con micoplasma, hongos o levadura.
Esta es la tincion de Hoechst, el cual es un compuesto que se intercala en el ADN, y emite fluorescencia a cierta longitud de onda. A la hora de revelar la tincion, en el miscropio se vera, una zona de densa coloración que sera el núcleo, y otros puntos de luminiscencia que serán las mitocndrias y en menor tamaño serán los contaminantes. No llegamos a revelar la tincion por cuestiones de tiempo
También vale nos enseño a usar la cámara de Neubauer. Esta cámara es un portaobjeto que tiene una grilla hecha y permite contar facilmente las células. El numero contado por diez a la cuarta, es la cantiad de células que hay en un mililitro de medio.
la semana que viene les contamos como nos fue con la tincion
Esta es la tincion de Hoechst, el cual es un compuesto que se intercala en el ADN, y emite fluorescencia a cierta longitud de onda. A la hora de revelar la tincion, en el miscropio se vera, una zona de densa coloración que sera el núcleo, y otros puntos de luminiscencia que serán las mitocndrias y en menor tamaño serán los contaminantes. No llegamos a revelar la tincion por cuestiones de tiempo
También vale nos enseño a usar la cámara de Neubauer. Esta cámara es un portaobjeto que tiene una grilla hecha y permite contar facilmente las células. El numero contado por diez a la cuarta, es la cantiad de células que hay en un mililitro de medio.
la semana que viene les contamos como nos fue con la tincion
Semana 9 10/9
Como el Dr. Muñoz se fue a Europa a una seria de conferencias y meetings, por el mes de Septiembre vamos a estar con la Dra Valeria Buggian, que es la encargada del cuarto de cultivo para el grupo ARK.
El jueves 9/10 vale nos explico en consiste su trabajo. Después fuimos al cuarto de cultivo, nos explico el funcionamiento en general del cuarto, y las responsabilidades.
También, vale habia preparado unas placas con células para que nos encarguemos por este mes de su mantenimiento. Entonces, ese jueves lo que hicimos fue hacer un pasaje. Este pasaje consiste en primero ver en que esta están las células de la plica, es decir cuantas células, aproximadamente, hay en la placa. Esto se hace para saber, mas o menos que dilución hay que hacer. Una vez que sabes cuantas células hay, se retira el medio, se lo lava con PBS (una solución isotónica, se retira el PBS, se agrega tripsina que sirve para que las células se despegan de las proteínas que están haciendo de matriz extracelular. Esperamos unos minutos, le agregamos un poco de medio que tiene proteínas bobinas y tomamos la alícuotas deseadasegún la dilución que queramos hacer.
El jueves 9/10 vale nos explico en consiste su trabajo. Después fuimos al cuarto de cultivo, nos explico el funcionamiento en general del cuarto, y las responsabilidades.
También, vale habia preparado unas placas con células para que nos encarguemos por este mes de su mantenimiento. Entonces, ese jueves lo que hicimos fue hacer un pasaje. Este pasaje consiste en primero ver en que esta están las células de la plica, es decir cuantas células, aproximadamente, hay en la placa. Esto se hace para saber, mas o menos que dilución hay que hacer. Una vez que sabes cuantas células hay, se retira el medio, se lo lava con PBS (una solución isotónica, se retira el PBS, se agrega tripsina que sirve para que las células se despegan de las proteínas que están haciendo de matriz extracelular. Esperamos unos minutos, le agregamos un poco de medio que tiene proteínas bobinas y tomamos la alícuotas deseadasegún la dilución que queramos hacer.
jueves, 3 de septiembre de 2009
Semana 8 3/9
El jueves 20/8 y 27/8 mati y yo estábamos en bariloche, con lo cual no fuimos al laboratorio.
Lo que hicimos hoy fue extraer y purificar ARN de dos lineas celular, que habían sido tratadas con luz UVC y UVB, con su correspondiente control.
Lo que se hizo fue poner a las células en un medio con Fenol y acetato de sodio, para destruir las mebranas y distintos componentes celulares. Luego se recogen las celulas en un tubo eppendorff y se le agregan 0.2ml de cloroformo, cuya función es ayudar a destruir y a separa en dos fases(ya que es menos polar que el fenol)
Después se mezcla y se centrifuga, lo que genera 2 fases una acuosa y otra orgánica. A nosotros nos interesa la fase acuosa, polar, ya que el ARN es polar. A la fase acusa se la agrega 0.5ml de isopropanol lo que baja la polaridad del medio, generando que el ARN precipite. Después de dejarlo a temperatura ambiente por 20 min se lo centrifuga a 12.000G por 10 min. Cuando se retiran los tubos de la centrifuga se ve en el fondo un precipitado(pellet) que esta fuertemente agarrada al tubo. Se descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de etanol 70% y se centrifuga a 7600g por 5 min. Se descarta el sobrenadante, con cuidado ya que la polaridad del etanol 70% es bastante intermedia y el ARN es parcialmente soluble en el mismo.Una vez descartado el sobrenadante se dejan los tubos abiertos para que se evapore lo que haya quedado de etanol.Una vez seco se le agregan 1.5-2ml de agua
Por ultimo se llevan los tubos a -80ºC por 5 min, después a 55ºC por 5 min y se vortexea.
finalmente tenemos al ARN, supuestamente puro.
Hay que destacar que lo mas complicado de una extracción no es la extracción en si mismo si no que es la predicación, extraer solamente lo de interés y no lo que es parecido, como puede ser el ADN. Es por eso que se juega con la polaridad del medio, ya que el ADN es menos polar que el ARN ya que cuenta con un OH menos(ácido DESOXIribonucleico)
Esta extracción y purifican viene seguida de una retrotranscripcion, un PCR radiactiva, y una electroforesis en poliacrilamida.
La semana que viene Manu se va a dar unas charlas por eruopa, con lo que no vamos a tener pasantia hasta el 8 de octubre. a la vuelte les traemos novedades
saludos
Lo que hicimos hoy fue extraer y purificar ARN de dos lineas celular, que habían sido tratadas con luz UVC y UVB, con su correspondiente control.
Lo que se hizo fue poner a las células en un medio con Fenol y acetato de sodio, para destruir las mebranas y distintos componentes celulares. Luego se recogen las celulas en un tubo eppendorff y se le agregan 0.2ml de cloroformo, cuya función es ayudar a destruir y a separa en dos fases(ya que es menos polar que el fenol)
Después se mezcla y se centrifuga, lo que genera 2 fases una acuosa y otra orgánica. A nosotros nos interesa la fase acuosa, polar, ya que el ARN es polar. A la fase acusa se la agrega 0.5ml de isopropanol lo que baja la polaridad del medio, generando que el ARN precipite. Después de dejarlo a temperatura ambiente por 20 min se lo centrifuga a 12.000G por 10 min. Cuando se retiran los tubos de la centrifuga se ve en el fondo un precipitado(pellet) que esta fuertemente agarrada al tubo. Se descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de etanol 70% y se centrifuga a 7600g por 5 min. Se descarta el sobrenadante, con cuidado ya que la polaridad del etanol 70% es bastante intermedia y el ARN es parcialmente soluble en el mismo.Una vez descartado el sobrenadante se dejan los tubos abiertos para que se evapore lo que haya quedado de etanol.Una vez seco se le agregan 1.5-2ml de agua
Por ultimo se llevan los tubos a -80ºC por 5 min, después a 55ºC por 5 min y se vortexea.
finalmente tenemos al ARN, supuestamente puro.
Hay que destacar que lo mas complicado de una extracción no es la extracción en si mismo si no que es la predicación, extraer solamente lo de interés y no lo que es parecido, como puede ser el ADN. Es por eso que se juega con la polaridad del medio, ya que el ADN es menos polar que el ARN ya que cuenta con un OH menos(ácido DESOXIribonucleico)
Esta extracción y purifican viene seguida de una retrotranscripcion, un PCR radiactiva, y una electroforesis en poliacrilamida.
La semana que viene Manu se va a dar unas charlas por eruopa, con lo que no vamos a tener pasantia hasta el 8 de octubre. a la vuelte les traemos novedades
saludos
jueves, 6 de agosto de 2009
Semana 7 6/8
Hoy, después de un buen tiempo sin vernos, nos reencontramos con Manu.
Mati no puedo ir porque tenia que rendir un final de IPC por UBA XXI
En este periodo en el que no estuvimos, manu siguió investigando el cambio en los patrones de Splicing Alternativo en células irradiadas con luz UVB, que es la que llega a la tierra desde el sol. En ese tiempo, después de analizar resultados se dio cuenta que el cambio en lo patrones de SA en células irradiadas con luz UVC no es dependiente de la posibilidad de realizar apoptosis por parte de la célula. Y también vio que el cambio en los patrones de SA por daño con UVC no depende de esta posibilidad de morir, que se ve representada en la célula por el aumento o disminución de el factor de transcripción p53. Pero, en oposicion, para que el daño con UVB (de menor energía que la UVC)cambie los patrones del SA SI tiene que estar presente p53. En realidad esto es un leve indicio.
Por esto es que hoy irradiamos con luz UVB y UVC a unas células sin la posibilidad de aumentar la cantidad de p53 y otras que si tienen la capacidad de aumentar la cantidad de p53. La semana que viene les contamos los resultados
Esto es todo por esta semana.
En los proximos días vamos a subir la introducción que tenemos que entregar para el 19/8
Saludos
Mati no puedo ir porque tenia que rendir un final de IPC por UBA XXI
En este periodo en el que no estuvimos, manu siguió investigando el cambio en los patrones de Splicing Alternativo en células irradiadas con luz UVB, que es la que llega a la tierra desde el sol. En ese tiempo, después de analizar resultados se dio cuenta que el cambio en lo patrones de SA en células irradiadas con luz UVC no es dependiente de la posibilidad de realizar apoptosis por parte de la célula. Y también vio que el cambio en los patrones de SA por daño con UVC no depende de esta posibilidad de morir, que se ve representada en la célula por el aumento o disminución de el factor de transcripción p53. Pero, en oposicion, para que el daño con UVB (de menor energía que la UVC)cambie los patrones del SA SI tiene que estar presente p53. En realidad esto es un leve indicio.
Por esto es que hoy irradiamos con luz UVB y UVC a unas células sin la posibilidad de aumentar la cantidad de p53 y otras que si tienen la capacidad de aumentar la cantidad de p53. La semana que viene les contamos los resultados
Esto es todo por esta semana.
En los proximos días vamos a subir la introducción que tenemos que entregar para el 19/8
Saludos
Receso
Debido a la emergencia sanitaria, no fuimos durante dos semanas a la pasantia.
A estas dos semanas se les sumaron las 2 semanas de receso invernal.
Con lo cual no fuimos a la pasantia por un mes.
A estas dos semanas se les sumaron las 2 semanas de receso invernal.
Con lo cual no fuimos a la pasantia por un mes.
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